ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原抗體的特異性反應與酶對底物的高校催化作用相結合起來的一種敏感性很高的實驗技術。根據檢測時標本以及檢測目的等的不同具體可以設計出不同類型的ELISA方法，例如間接法、雙抗體夾心法和競爭結合。

　　實驗前準備

　　先準備好本次實驗所需的各種試劑和耗材

　　1.試劑：

　　人TNF-αELISA試劑盒，包含：

　　預包被抗人TNF-α單抗的96孔酶標板

　　凍干的人TNF-α標準品

　　樣品稀釋液

　　生物素標記的TNF-α抗體(或濃縮液，需自行稀釋)

　　親和素-HRP(或濃縮液，需自行稀釋)

　　TMB(POD)顯色底物

　　終止液

　　洗板液(濃縮液或即用型)

　　2.耗材：

　　1.5mL離心管

　　QSP盒裝吸頭(10µL,100µL,1000µL等，根據需要選擇)

　　冰盒

　　ELISA蓋板膜

　　3.儀器設備：

　　單通道移液器(可根據需要添加多通道移液器)

　　全波長掃描多功能讀數儀(酶標儀)

　　渦旋振蕩器

　　4.其他：

　　量筒/燒杯

　　吸水紙

　　計時器

　　實驗操作

　　樣品稀釋

　　1.準備稀釋液：將凍干的人TNF-α標準品用適量超純水復溶，配制成濃度為2000pg/mL的標準品原液（或儲備液）。

　　2.標記離心管：取8只1.5毫升離心管做好濃度標記，按照濃度從高到低依次排列，并標明單位。假設你想要配置的是從1000pg/mL開始，5倍系列稀釋的標準品，那么8個離心管的濃度標記應該是：

　　1000pg/mL

　　200pg/mL

　　40pg/mL

　　8pg/mL

　　1.6pg/mL

　　0.32pg/mL

　　0.064pg/mL

　　0pg/mL(空白對照，通常用稀釋液代替)

　　3.加入稀釋液:在1000pg/mL到0.064pg/mL的7個離心管中，分別加入400µL稀釋液。在0pg/mL的空白對照管中加入900µL的稀釋液。

　　4.配制1000pg/mL標準品:吸取100µL2000pg/mL的標準品原液加入到含有400µL稀釋液的1000pg/mL離心管中，充分混勻。

　　5.系列稀釋:從1000pg/mL的離心管中吸取100µL，加入到200pg/mL的離心管中，充分混勻。更換新的槍頭。從200pg/mL的離心管中吸取100µL，加入到40pg/mL的離心管中，充分混勻。更換新的槍頭。以此類推，直到稀釋到0.064pg/mL。每次轉移都必須更換新的槍頭。

　　6.空白對照:0pg/mL的離心管中不加標準品，只含有900µL的稀釋液。

　　免疫反應

　　接下來進入免疫反應實驗，將所有試劑從冰箱中取出，平衡至室溫。

　　按照50µL/孔的體積，將空白對照、標準品和稀釋后的待測樣品加入到酶標板中。注意標準品按照濃度梯度依次加樣，并做好標記。

　　加樣完畢后，輕輕拍打酶標板，使液體充分混勻。用封板膜封住酶標板，室溫孵育1小時。孵育結束后，揭去封板膜，棄去孔內液體，用洗板液洗滌酶標板3次。

　　按照100µL/孔的體積，加入按說明書稀釋好的生物素標記的TNF-α二抗，用封板膜封住酶標板，室溫孵育1小時。孵育結束后，揭去封板膜，棄去孔內液體，用洗板液洗滌酶標板3次。

　　按照100µL/孔的體積，加入按說明書稀釋好的HRP，用封板膜封住酶標板，室溫避光孵育30分鐘。孵育結束后，揭去封板膜，棄去孔內液體，用洗板液洗滌酶標板3次。

　　按照100µL/孔的體積，加入TMB顯色底物，用封板膜封住酶標板，室溫避光孵育30分鐘(具體時間請參考試劑盒說明書)。

　　加入終止液(例如硫酸或鹽酸)終止反應。在酶標儀上，選擇合適的波長(例如450nm,405nm或490nm，請參考試劑盒說明書)讀取各孔的OD值。

　　最后大家可以進行實驗的結果分析，因為篇幅有限，實驗操作步驟分享到這里，上述實驗步驟僅供參考。如果您對ELISA實驗步驟進一步了解，可以和紀寧生物在線顧問尋求幫助!紀寧生物也提供代測服務。