圖片來源：ACS Catal.

首先對純化的GM進行了表征，在37℃時，催化L-glutamate轉化為3-甲基天冬氨酸的比活力為7.5u/mg。同時，選擇了一種來源于抗輻射不動桿菌的、對L-天冬氨酸具有高β-脫羧活性的Asd（ArAsd）作為促進3-甲基天冬氨酸轉化為L-ABA的第二種酶。然而，由于底物的特異性，沒有檢測到WT-ArAsd對3-甲基天冬氨酸的活性，這也是氨基酸脫羧酶的一個顯著特征。為了提高3-甲基天冬氨酸β-脫羧活性，在酶結構的基礎上進行了對ArAsd分子改造。底物進入活性位點的通道有兩個重要的氨基酸殘基S486和K18，將K18變成A18后，在結構上通道口變大。

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為了進一步提高ArAsd對3-甲基天冬氨酸的活性，考慮對催化口袋進行進化。Asd屬于I型PLP酶家族，將L-天冬氨酸轉化為L-丙氨酸和CO₂，PLP共價結合在催化口袋的Lys315上，ArAsd中對應的殘基為Lys314。因此，首先考慮PLP 5A范圍內的殘基。為了確定調控底物特異性的關鍵殘基，對這些殘基進行了丙氨酸掃描誘變，結果是雙突變K18A/V287I的酶活最高。

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最終，以谷氨酸為唯一底物，通過GM與Asd的偶聯反應，構建了合成L-2-氨基丁酸的級聯反應。根據GM和K18A/V287I的特性，反應在pH 6.6和37℃下進行，培養4h后，L-谷氨酸（4.5mm）轉化率為90%，檢測到L-ABA的含量為4.45mM，L-谷氨酸轉化為L-ABA的轉化率高達98.9%。

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參考文獻：Enzymatic Biosynthesis of L?2-Aminobutyric Acid by Glutamate Mutase Coupled with L?Aspartate-β-decarboxylase Using L?Glutamate as the Sole Substrate

ACS Catal.

DOI：10.1021/acscatal.0c04141